본 글에서는 앞선 글에서 살펴본 PCR 기술의 확장으로 그 응용 기술과 PCR 기술 활용 분야에 대해 조금 더 자세히 알아보도록 하겠습니다.
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PCR 기술 활용 분야
PCR 방법에는 사용되는 주형에 따라 크게 두 가지로 나뉜다. 즉, DNA를 주형으로 하여 특정 DNA 부분을 증폭하는 PCR 방법과 RNA(리보핵산)를 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA, complementary DNA(RNA에 상보적인 DNA)를 합성한 다음 이로부터 특정 DNA 부분을 증폭하는 역전사 중합효소연쇄반응RT-PCR, reverse transcription polymerase chainreaction이 있다. PCR을 응용하여 개발된 방법에는 세포 내 RNA와 DNA의 양을 측정할 수 있는 quantitative PCR 정량법, 세포 간 다르게 발현되는 전사물을 검출할 수 있는 DD RT-PCR법, 유전자의 특정 부위를 클로닝할 수 있는 RACE, DNA의 특정 부위의 변이를 검출할 수 있는 SSCP법, 생체에서 직접 DNA를 검출할 수 있는 in situ PCR세포 내 PCR 반응법 등이 있으며, 현재에도 여러 분야에 적용하기 위한 다양한 종류의 새로운 기술들이 고안되고 있다.
역전사 중합효소연쇄반응
RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 방법은 RNA 추출, 역전사 효소 reverse transcriptase 및 mRNA의 3. 말단에 존재하는 poly (A)를 이용하여 RNA로부터 CDNA를 제조하는 과정과 CDNA를 이용하여 특정 부위를 증폭시키는 과정으로 구성되어 있다. 본 방법은 RNA의 분석에 일반적으로 사용되는 Northern blothybridization(RNA 검출혼성화법) 방법보다 실험 방법이 간단할 뿐만 아니라 소량의 RNA에서도 각종 분석이 가능하기 때문에 RNA로부터 특정 유전자의 클로님 및 RNA 정량 실험에 많이 적용, 활용되고 있다. 특히 미량으로 존재하는 여러 종류의 시료를 동시에 해석하는 임상 진단에 폭넓게 응용되고 있다.
정량적 중합효소연쇄반응
(Quantitative PCR)
PCR법을 이용하여 DNA 또는 RNA의 양을 측정하기 위한 방법으로 경쟁적competitive PCR 법과 실시간real-time PCR법이 있다.
경쟁적 중합효소연쇄반응
(competitive PCR)
‘DNA competitor’ 라고 하는 DNA 단편을 인위적으로 PCR 반응액에 첨가하여 목적 target DNA와 동시에 증폭시키고 난 뒤, 이미 양을 알고 있는 DNA(competitor)에서 증폭된 DNA의 산물을 대조군으로 하여 목적 DNA의 양을 추정하는 방법이다(그림 4). DNA competitor는 일반적으로 목적 DNA의 중간 부분이 제거된 DNA 단편으로 목적 DNA와 동일한 프라이머가 붙을 수 있도록 설계되기 때문에 PCR 반응시 목적 DNA와 거의 동일한 조건에서 증폭되나, 증폭된 PCR 산물인 DNA의 길이가 서로 다르기 때문에 목적 DNA와 competitorDNA에서 증폭된 DNA는 구별될 수 있다. competitivePCR법을 mRNA 정량에 응용한 것이 competitive RT-PCR이며, DNA 정량에 응용한 것이 일반적인 ‘competitive PCR법’ 이다.
실시간 중합효소연쇄반응
(Real-time PCR)
Real-time PCR법은 형광 물질로 표식한 PCR 산물의 증폭량을 실시간으로 신속하게 확인하면서 해석하는 방법으로 전기영동에 의한 PCR산물의 확인이 필요 없이 핵산의 초기량을 정확히 정량해낼 수 있는 방법이다. 시료의 마개를 열지 않고도 반응산물의 농도를 바로 알 수 있기 때문에 실험실을 PCR산물로 오염시키지 않아도 되는 장점도 가진다. Real-timePCR법에서는 전체 반응을 추적하기 위해 형광 표지물질을 사용하며, 이러한 형광 물질은 증폭의 매 주기마다 산물이 축적됨에 따라 비례하여 증가 하게 된다. 증폭의 초기에는 형광의 증가가 감지되지 않으나 일정 cycle이지나면서 축적된 형광량이 기기에 감지되고, 감지되는 시점의 cycle수를감지 시작 주기 threshold cycle이라고 한다. 주형Template 초기량의 log값과 threshold cycle 사이에는 직선적으로 비례하는 관계를 가지기 때문에, 초기량을 아는 핵산을 이용하여 초기량의 log 값과 그에 해당하는threshold cycle를 이용하여 표준 검량곡선을 얻을 수 있고, 이 표준 검량곡선을 이용하면 미지 시료에 대한 초기량을 정확하게 계산해낼 수 있다.본 방법에서는 형광 표지물질을 사용하므로 일반적인 PCR 기계에 요구되는 thermal cycle과 분광형광광도계를 일체화시킨 장치가 요구된다.
발현차 검출 역전사 중합효소연쇄반응
(DD RT-PCR differential display reverse transcription-polymerase chain reaction)
고등동물에서는 약 3만 개~5만 개 정도의 유전자가 발현되고 있으며, 그중 일부가 특정 조직, 특정 시기에 선택, 발현되어 위 또는 간과 같은특정 조직의 특징 및 기능을 보유하게 된다. DD RT-PCR법은 특정 세포 및특정 시기에 특이적으로 발현되는 특정 유전자들을 찾아낼 수 있는 방법이다. 즉, 서로 다른 세포로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 여러특정 부위를 합성할 수 있는 다종의 프라이머 혼합물을 사용하여 cDNA로부터 각종 특정 부위를 증폭시키고, 증폭된 다종의 PCR 산물을 비교함으로써 세포 간 증폭된 PCR 산물의 차이를 확인하는 방법이다 (그림 5).
본 방법은 특정 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 검출할 수있는 일반적인 방법인 subtractive hybridization (공통유전자 제거 혼성화법)법 또는 differential hybridization(특이유전자 검출 혼성화법) 방법보다 훨씬 간단하지만, 실험의 감도와 특이성 등은 개선해야 할 부분이 남아있다.
cDNA 말단의 급속 증폭법
(RACE rapid amplification of cDNA ends)
본 방법은 CDNA의 양 말단을 클로닝하기 위한 방법으로 일반적인 cDNA cloning 미수정란의 핵을 체세포의 핵으로 바꿔놓아 유전적으로 똑같은 생물을 얻는 기술방법인 CDNAlibrary screening방법에 의해서는 클로닝하기 어려운 DNA의 5 ‘말단의 클로닝에 특히 강력한 방법이다. 일부 염기서열을 알고 있는 cDNA의 부분에서 합성한 유전자 특이 프라이머와 공통적으로 사용할 수 있는 다른 하나의 프라이머를 사용하여 5′ 말단 혹은 3′ 말단까지의 DNA를 증폭함으로써 특정 유전자의 말단을 클로닝 할 수 있다. 3′ 말단 RACE에서는 mRNA의 3′ 말단에 존재하는 poly(A*)에 상보적인 oligo-(IT)프라이머를 공통 프라이머로 사용하고 5’ 말단 RACE 경우에는 말단 뉴클레오티드 전이효소(TdT :terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 1stsingle strand cDNA의 말단에 poly(A*) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 합성한 후 여기에 상보적인 DNA를 공통 프라이머로 사용한다(그림 6).
본 방법은 미량으로 존재하는 유전자 또는 길이가 긴 유전자의 양말단을 클로닝 할 경우에 효율적으로 사용할 수 있는 방법이다.
PCR산물의 단본쇄 배열 다형체 분석법
(PCR-SSCP: PCR-Single Strand Conformational Polymorphism)
SSCP법은 1989년 오리타 등에 의해 고안된 것으로 유전자의 돌연변이를 검색하는 데 유용한 방법이다. 외가닥의 단본쇄 DNA는 singlestranded DNA 비변성조건 non-denaturing condition 하에서 DNA의 염기서열에 의해 분자 특유의 2차 구조가 형성되고, 이는 전기장 내에서의 분자 고유의 이동 속도를 갖게 한다. 그래서 만약 DNA염기서열 중 하나의 염기서열 변화가 발생해도 전기영동상에서 분자의 이동 거리 차이가 발생되어 원래의 유전자 변이된 유전자가 구별된다(그림 7). 이와 같은 원리를 PCR산물에 적용한 것이 PCR-SSCP법이다. 최근에는 방사성 동위원소 대신 은염색법을 사용하여 단시간에 방사성 동위원소와 같은 정도의 민감도로 PCR산물을 분석할 수 있어 더욱 편리하고 안전하게 유전자의 돌연변이 실험에 사용되고 있다.
세포 내 중합효소연쇄반응
(ISPCR: in situ polymerase chain reaction)
ISPCR은 PCR법과 ISH, in situ hybidization의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 감도와 ISH 의 특이성을 골고루 갖추고 있다. 즉, 본 방법에 의해 세포나 조직상에서 극미량으로 존재하는 DNA 및 RNA를 검출할 수 있다. ISPCR의 실험 원리는 일반적인 PCR방법과 같으나, 세포상에서 target DNA를 증폭시켜야 하기 때문에 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하다. 현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 않으나 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 기대되기 때문이다.
