본 글에서는 PCR 기술에 대해 알아보도록 하겠습니다.
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PCR 기술의 탄생
중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 20세기 생명공학 연구 분야에서 뿐만 아니라, 적은 양의 DNA에서 많은 양의 DNA를 인공적으로 합성할 수 있는 과학사의 선구적인 기술 중 하나로 인정받고 있습니다. 반복되는 반복을 통해 시험관 내에서 DNA의 특정 부분을 합성합니다. 현재 생물학, 의약, 농업 등 생명과 관련된 분야의 기초부터 응용에 이르기까지 다양한 분야에서 활용되고 있는 기술이 있으며, 유전질환 진단, 병원 바이러스 및 세균 검출, 인간 진화 연구 등에 활용되고 있다. 이집트 미라의 특정 DNA를 탐지할 수 있을 뿐만 아니라 현장에 남겨진 머리카락 한 방울이나 핏방울에서도 범인의 DNA를 추적할 수 있는 획기적인 기술이다.
중합효소연쇄반응은 1983년 캘리포니아 Cetus Biotechnology에서 일하는 화학자인 Dr. Mullis가 특별히 고안하고 고안한 기술입니다. Muris 박사는 1972년 University of California, Berkeley에서 생화학 박사 학위를 받았으며 1979년부터 7년 동안 Cetus에서 DNA 단편 합성을 담당했습니다. 더 긴 DNA? 항상 밤에 샌프란시스코에서 멘데시노까지 128번 고속도로를 운전할 생각을 하는 그는 운전하면서 좋은 아이디어를 떠올리는 것을 좋아합니다.
PCR 기술의 기본 개념은 시험관 내 세포에서 DNA 복제 기계를 반복하여 DNA의 특정 부분을 대량으로 증폭하는 것입니다. 즉, 이중나선 DNA를 주형으로 하고 DNA 프라이머와 짧은 DNA 단편을 기점으로 DNA 중합효소 반응을 통해 각 주형에 상보적인 4개의 deoxyribonucleotide를 추가하여 새로운 100만개 이상의 증폭된 DNA 단편을 합성합니다. DNA가 20회 이상 반복되더라도 단일 DNA에서 얻을 수 있습니다.
이러한 과정에서 가장 중요한 구성요소는 DNA 중합효소로, 일반적의 DNA 중합효소는 37도에서 최적의 활성을 유지하며 고온에서의 활성을 잃게 된다. 멀리스 박사가 초기에 사용한 효소도 박테리아에서 유래한 전형적인 DNA 중합효소로 고온에서는 활성을 잃는 효소였다. 그러나 DNA 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응에서는 복제된 두 가닥의 DNA에서 새로운 DNA를 복제하기 위해서는 이중가닥의 DNA에서 외가닥의 DNA로 분리되어야 하며 이때 높은 온도로부터 열에너지를 필요로 하게 된다. 그러나 초기에 사용한 박테리아 DNA 중합효소는 높은 온도에서 효소 활성을 잃어버리게 되므로 PCR 반응의 매 단계마다 신선한 효소를 첨가 했다. 또한 각 반응의 최적 온도의 각기 다른 온도의 반응수조로 복제시료를 옮겨야 하는 번거로움이 있었다. 그러나 약 30년 전 미국 위스콘신대학의 생물학과 교수였던 브록 박사가 발견한 고온에서 최적의 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 PCR 기술에 적용함으로써본 기술은 한층 더 완성 단계에 근접하게 된다. TaqDNA 중합효소는 미국의 옐로스톤국립공원에 서식하는미생물 중, 100도에 가까운 온천에서 살고 있는Thermus aquaticus라는 미생물에서 추출 분리한 것으로 높은 온도에서 매우 안정적이고 효율적인 활성을 지닌다. 이와 더불어 각기 다른 온도에서의 중합효소연쇄반응을 자동적으로 수행할 수 있는 기계인 PCR cycler를 개발, 적용함으로써 PCR 기술은 생명공학 관련 과학기술에 있어서 획기적인 기술로 자리매김하게 된다.
실제로 PCR 기술의 기본 개념은 1971년 위스콘신대학의 코라나H.G.Khorana가 발표한 논문에 이미 서술되어 있었으나, 그 당시의 과학적 지식과 기술의 진보가 충분하지 못하여 구체화되지 못했다가, 그로부터 10년 후 멀리스 박사에 의해 내열성 Taq DNA 중합효소의 사용과 자동화 기계의 적용 등으로 실용화되었다. 멀리스 박사는 1986년에 이 혁신적인DNA 증폭기법을 콜드스프링하버연구소에서 개최한 심포지움에서 처음으로 보고하였다. 그 후 PCR 기술은 분자생물학, 의학 등의 폭넓은 여러 분야에 활용되어 모든 생명과학연구 분야의 발전을 이끌어낸 혁명적인 기술로 인정되어 1993년에 노벨 화학상을 위시한 수많은 권위 있는 국제상을수상하게 된다.
유전자란
인체에는 약 100조 개의 세포가 있으며 각 세포에는 46개의 염색체가 있습니다. 각 염색체에는 압축된 이중 나선 DNA 가닥이 있습니다. DNA 가닥에는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)의 4개 염기가 30억 쌍이 있습니다. DNA에는 단백질을 합성하는 DNA 엑손과 단백질 합성에 관여하지 않는 DNA 인트론이 있습니다. 좁은 의미의 엑손을 유전자라고 하고 넓은 의미의 엑손과 인트론을 유전자라고 합니다.
인간의 유전자 수
인간게놈프로젝트 연구팀은 DNA염기서열 30억 쌍 중 27억 쌍을공개했다. 그러나 인간 게놈, 즉30억의 염기쌍에 몇 개의 유전자가 존재하는지는 알지 못한다. 특정 염기쌍으로 배열되는 유전자는3만 개에서 15만 개에 이르기까지다양하게 추정되고 있다. 일부 과학자들은 99년 12월과 지난 5월염기서열을 해독한 21번과 22번염색체(인간 게놈 크기의 2퍼센트에서 770개의 유전자를 찾은점에 착안, 인간 게놈의 총 유전자수를 3만 8천여 개로 추정하기도했다. 다른 과학자들은 이보다 적은 2만7천 700개, 또 다른 과학자들은최대 15만 개 이상이라고 주장하기도 했다.
PCR 기술의 원리
PCR 기술의 원리는 DNA의 양쪽 가닥을 주형으로 특정 영역의 DNA에 DNA 합성의 시발체인 두 개의 프라이머가 붙고 DNA 중합효소반응에의해 새로운 DNA가 신장, 반복됨으로써 시발체 사이의 DNA 단편을 증폭하는 것을 말한다. (그림1) DNA 합성을 시작하기 위해서는 외가닥 DNA가 있어야 하므로 이중가닥으로 되어 있는 주형 DNA를 고온(95)에서 변성시켜야 한다. 그 후, 변성된 외가닥 DNA의 양 끝에 상보적으로 결합할수 있는 작은 DNA조각을 첨가하여 낮은 온도(50~65도)에서 결합시킨다.새로운 DNA가 합성될 수 있도록 72도에서 TaqDNA 중합효소를 반응시킨다. 이렇게 ‘변성→결합→ 신장의 과정이 수회 내지 수십 회 반복 수행되어 특정 부위의 DNA가 증폭된다. (그림2) 30회를 반복하여 증폭시킬 경우에는 2″수만큼 증폭된 DNA 단편을 얻게 된다. PCR을 이용한 DNA증폭효율은 아래의 여러 요인에 의해 영향을 받게 된다.
각 스텝별 반응온도 및 반응시간
열변성조건으로는 94도, 30초에서 1분을 표준으로 하며 PCR 반응액의 양이나 원하는 DNA서열의 GC함량(DNA구성 성분인 AGIC 중에서 GC가포함된 량)에 따라 온도와 시간에 변화를 줄 수 있다. 실제 극소량을 이용한일반적인 반응에서는 1분의 변성시간으로 충분하다. 외가닥의 DNA에 상보서열인 프라이머의 결합은 각 프라이머의 해리온도(Tm)에 따라 설정하며 통상 1분이 적당하다. 비정상적인 결합이 많은 경우에는 온도를 일정한간격으로 올리고 반대로 결합이 되지 않는 경우에는 온도를 내려서 특이적인 결합을 유도하기도 한다.
신장반응의 경우는 통상 72도에서 반응하며 목적 DNA 단편의 길이에 따라 시간이 정해지며 1kb (1킬로베이스=1000개 염기수) 이하의 길이에는 1분으로 충분하며 Taq 중합효소를 사용할 경우 길어야 3분에서 5분을 넘기지 않는다. 그러나 목적 DNA 단편이 수십 kb에 해당하는 PCR 반응의 경우에는 10분 이상의 시간을 수행하기도 한다.
회전수
실제 PCR을 이용한 목적 DNA의 증폭은 n회의 cycle로 반응을 할 경우 2″ 배가 되지만 그만큼의 효율을 나타내지는 못한다. 목적 DNA의 용도에 따라 증폭되는 양을 결정하는 cycle 수는 수회에서 수십 회로 그 범위가 넓으며 일반적으로 25에서 30cycle 이면 충분하다.
반응 용액의 조성
PCR 반응에 필요한 조성 성분에는 DNA 중합효소, 시발체(프라이머), 주형DNA 또는 RNA, 기질인 dNTP(DNA구성 화합물), Mg2+ (마그네슘)이온 외에도 반응첨가물 등이 있는데 이들 조성 성분들은 반응에 따라 최적농도나 조건이 요구된다. PCR 반응에 사용되는 주형 DNA의 제조원으로는 조직배양세포로부터 한 가닥의 머리털, 혈액, 그리고 포르말린으로 고정된 파라핀포리조직 등 다양하다. 최근 법의학 분석에서 전혈이나 머리털로부터 PCR 반응을 시행하고 있다고 한다.
프라이머의 설계
PCR로 특정 영역의 유전자를 증폭하려면 시발체가 되는 2종의 합성외가닥 DNA가 필요하며 이를 프라이머라고 한다. 실제 프라이머의 길이. 상보성, GC함량, 프라이머 내의 2차 구조 형성, 해리온도(Tm)값 및 사용농도 등을 고려한 프라이머의 설계가 PCR의 성패를 좌우하는 중요한 요인 중 하나이다. 현재는 다양한 프라이머 설계용 컴퓨터프로그램들이 제공되고 있다.
DNA 중합효소
PCR 기술의 자동화에 있어서 핵심 요소로 여러 생명관련회사에서 다양한 종류의 내열성 DNA 중합효소를 시판하고 있으며 실험 목적에 따라맞는 적당한 DNA 중합효소를 선택하게 된다. PCR 반응에 의해 증폭된 DNA 단편은 아가로우스겔 전기영동법과 폴리아크릴아미드겔 전기영동법상에서 확인되며 특히, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법은 저분자 DNA 해석에 유용하여 DNA 염기서열분석이나 DNA의 2차 구조를 확인할 수 있는 SSCPsingle strand conformational polymorphism (단본쇄배열다형체) 등에 사용되고 있다.
